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常見問題解答

  • 大腸表達中是否要去掉信號肽?

    信號肽的主要作用是促進蛋白質折疊成特定空間結構,同時它決定蛋白最終被定位到特定的亞細胞區。對于大多數大腸胞內表達模式來說,信號肽基本喪失了它的功能,同時信號肽的疏水性會造成蛋白大腸胞內表達中成不可溶狀態,所以通常在大腸表達中要去掉信號肽。

  • 表達出來的蛋白比實際大小要小,這是為什么?

    主要原因有如下幾個方面

    1. 蛋白本身被降解了,可以存在一些不利于該蛋白穩定的蛋白酶
    2. 翻譯起始位點的問題:如果一個類似于核糖體結合位點(AAGGAGG)的序列加上適當的間隔序列出現在了ATG密碼子上游,降解就會有可能出現。解決的方法可以采用兩端都帶有融合標簽的載體,例如pET系列部分載體在N-端和C-端都有His-Tag融合標簽。這樣,全長蛋白就可以通過提高咪唑濃度,在洗脫時將截短蛋白與全長蛋白區分開?;蛘咴诘鞍變啥瞬捎貌煌瑯撕?,進而通過親和純化的方式得到全長蛋白。
    3. 影響蛋白穩定性的另外一個因素是與N端Met相鄰的氨基酸,即N端原則,當下列氨基酸出現在N端時: Arg、Lys、Phe、Leu、Trp和Tyr?蛋白的半衰期較短,蛋白會存在不穩定降解的問題,特別是Leu,當它出現在第二個位置上時,蛋白極度不穩定。在選擇克隆位點時,?Nco I?和Nde I都是 是一個比較好的N端的克隆位點選擇,而使用NdeI的時候就要特別留意Leu的出現。
  • 表達的蛋白基本全是包涵體?

    使用野生型基因在大腸桿菌表達中形成包涵體的概率是很高的,為了減少包涵體的形成,文明建議大家采用基因合成的方式獲得基因。同時在實驗中,結合降低誘導溫度,例如12-20°C,降低IPTG濃度(0.01–0.1mM)并延長誘導時間,以及特殊培養基等手段獲得更多的可溶蛋白。另外,我們需要分析蛋白本身是否疏水,如果蛋白本身的疏水性比較強,我們需要采用促溶標簽融合表達蛋白來達到可溶的目的,如Trx,GST, NusA。但是形成包涵體也不是一個極壞的處境:往往包涵體表達量都非常高,而且純化起來方便更容易獲得高純度的蛋白樣品。對于一些需要蛋白去免疫動物制備WB類用途的項目來說,包涵體也是一個非常不錯的選擇。

    得到一定量的包涵體后,可以嘗試柱上復性或者透析/稀釋復性,

    柱上復性方式: 蛋白在變性狀態下上柱后,使用一定濃度的尿素或鹽酸胍、1mM還原型及0.2mM氧化型谷胱甘肽淋洗,隨后用咪唑洗脫。

    透析/稀釋復性:在透析去除尿素的過程中加入還原型及氧化型谷胱甘肽 或者CHAPs等表面活性劑可以有助于蛋白的正確折疊。

  • 如何提高蛋白的可溶性表達比例及表達量?

    有些蛋白質表達水平低,或者表達的大多是包涵體,通常情況下通過基因優化,載體及菌株的篩選,表達條件優化,誘導條件優化等可以有效增加蛋白的可溶性比率及表達量。

    1、密碼子優化

    密碼子優化是根據大腸對密碼子的偏好性進行優化篩選,一般選擇使用頻率大于20%的密碼子。經過優化的基因序列能提高mRNA二級結構的穩定性,避免因為不充足的tRNA庫導致翻譯延遲,成熟前翻譯終止,翻譯移碼和氨基酸錯配。

    2、降低蛋白表達速率
    通過降低IPTG的誘導濃度,降低蛋白的表達速率。通過調節促使肽鏈聚集的速率與其折疊速率平衡,有利于提高蛋白的可溶性表達。

    3、溫度
    37度的表達條件往往會使一些蛋白形成包涵體,而30度的表達條件則可能產生可溶的或者有活性的蛋白。在某些條件下(12-20度)延長誘導時間(過夜)會使溶解性蛋白的產量達到最大。

    4、細胞周質表達
    我們可以選用一些將蛋白運輸到細胞周質的載體。周質空間更有利于蛋白的正確折疊及二硫鍵的形成。常規選用的載體有pet22系列。但是我們要注意的是,有些蛋白并不適合于被運輸到周質空間,比如一些與β-gal融合的周質的內部被證明是有毒的。

  • 大腸桿菌在表達蛋白過程中越來越少?

    主要可能有兩種原因,一種是大腸在加入IPTG等誘導劑后大腸停止生長或者裂解,這時候我們要考慮蛋白本身對該菌是有一定毒性的,這時候我們可以選擇一些采用嚴緊控制的宿主菌株,比如帶有pLysS的菌株。另外一種原因就是很令人頭疼的了,當我們發現出現大面積搖瓶中細菌量逐漸降低甚至培養基回復到澄清狀態,就應該懷疑噬菌體污染的可能性了。

  • 用于表達蛋白的基因是釣取野生型還是通過基因合成獲得?

    多數氨基酸都有一個以上的密碼子,通過E.coli密碼子應用情況的分析表明一些密碼子很少被使用,尤其是Arg,IIE,Leu,Gly,Pro等氨基酸的部分密碼子。一個或多個tRNA的稀有或者缺少可能導致翻譯的終止, 盡管含有少量稀有密碼子不會給目的蛋白表達造成太大的影響,但是如果一個蛋白基因中含有多個或者成串稀有密碼子的時候,目的蛋白的表達將會非常低。如果是基因是野生型的,我們最好先對其做個稀有密碼子分析,如果密碼子稀有的程度不高,可以使用Rosetta菌株用于表達這些含稀有密碼子基因的目的蛋白。如果密碼子稀有程度過高,最佳的處理方式是經過密碼子優化后直接進行基因合成。

  • 如何獲得關于我的蛋白的一些相關信息?

    生命科學發展在現在,很多蛋白質都已經被研究過了或者正在被研究,對于已有前人研究基礎的蛋白質,我們可以借助NCBI和UniProt了解蛋白的結構及翻譯后修飾等相關信息,對于未被研究的蛋白質,我們可以借助一些預測網站或軟件分析蛋白質的信號肽,疏水性,拓撲結構,等電點等信息。

  • His 標簽蛋白沒有被洗脫下來

    a) 可能原因:洗脫條件太溫和(組氨酸標記的蛋白質仍然結合在柱上,結合力較強)

    解決方法:增加咪唑的梯度洗脫或降低pH 來找出最佳的洗脫條件。

    b) 可能原因:降低pH 的方法洗脫的,若pH 低于3.5,會導致鎳離子脫落

    解決方法:改變洗脫辦法,咪唑競爭性洗脫

    c) 可能原因:蛋白已沉淀在柱上

    解決方法: 減少上樣量,或使用咪唑的線性梯度而不是分步洗脫以降低蛋白的濃度。試用去污劑或改變NaCl 的濃度,或在變性條件( 去折疊) 下洗脫( 用4-8 M 脲,或4-6 M 鹽酸胍)。

    d) 可能原因:非特異性疏水或其他相互反應

    解決方法: 加非離子去污劑到洗脫緩沖液(如:2% Triton X-100)或增加NaCl 的濃度。

  • 蛋白定量有哪些方法?

    紫外檢測法(紫外光譜吸收法):色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在280nm附近,而大多數蛋白質含有這兩種氨基酸殘基,所以測定蛋白質溶液280nm的光吸收值可以快速簡便地分析溶液中蛋白質的含量。

    考馬斯亮藍染色法:考馬斯亮藍G-250有紅、藍兩種不同顏色的形式。在一定濃度的乙醇及酸性條件下,可配成淡紅色溶液,當與蛋白質結合后,產生藍色化合物,反應迅速而穩定。藍色復合物在595nm波長處具有最大光吸收值,并與溶液中蛋白質濃度成正比,因此可檢測595nm的光吸收值大小計算蛋白質的含量。

    BCA(二喹啉甲酸)檢測法:在堿性環境下蛋白質分子中的肽鍵能與Cu2+還原成Cu+。而BCA試劑可敏感特異地與Cu+結合,形成穩定的紫色復合物,在562nm處有最大光吸收值。顏色的深淺與蛋白質濃度成正比,可根據的光吸收值大小計算蛋白質的含量。這是近年來新研制的一種改進的Lowry測定法,反應簡單而且幾乎沒有干擾物質的影響。

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